同一个基因通过不同的RNA剪接方式产生多种RNA转录本和蛋白质，是真核细胞转录组与蛋白组复杂性的主要来源之一，也是基因功能调控的重要方式。RNA剪接受到复杂且动态的调控，与肿瘤、发育异常和神经系统疾病等多种疾病密切相关。细胞中多种RNA结合蛋白（RBP）是RNA剪接的核心调控因子。在复杂生理与病理环境下，哪些RBP调控哪些RNA剪接事件？不同细胞中RNA剪接的调控因子有什么差异，如何导致异质性的剪接谱？针对这些问题长期缺乏系统性的研究手段。
近日，清华大学生命科学学院杨雪瑞课题组开发了一种基于可解释机器学习的新型计算方法，利用单细胞RNA测序数据所蕴含的异质性特征，系统解析细胞类型特异的RNA可变剪接调控规律。相关研究以“可解释机器学习利用单细胞RNA测序数据解析细胞类型特异的剪接调控”（Interpretable machine learning enables de novo mapping of cell type-specific RNA splicing regulation from scRNA-seq data）为题，发表于《自然-通讯》（Nature Communications），并收录于“RNA生物学人工智能”集合（Artificial intelligence in RNA biology）。
图1. 可解释机器学习解析复杂生理组织中细胞类型特异的剪接调控
杨雪瑞课题组近年来持续关注单细胞解析度下RNA剪接谱中所蕴含的丰富信息。此前，课题组的向贤珂博士已开发SCASL方法，重点解决“如何从单细胞数据中准确刻画RNA剪接状态及其细胞异质性”的问题，利用RNA剪接信息提出多种复杂组织中细胞亚群的新定义（Nature Communications, 2024, www.nature.com/articles/s41467-024-46480-9）。
在新的研究中，团队进一步发现针对RNA剪接调控关系的推断这一复杂任务，单细胞RNA-seq数据具备独特优势：1. 剪接状态的高度极化，即单个细胞中某个基因的转录本往往由单一异构体主导，其它可变剪接状态很少。这种极化分布意味着每个细胞反映的是在特定状态下一个"干净的"间接调控决策，而非多种调控程序的混合。2. 复杂组织中天然存在不同细胞的RBP 表达和剪接状态的异质性，这相当于提供了大量生理扰动实验作为信息源，支持对剪接调控关系的推断。3. 以单细胞为观察单元，产生极大样本量的数据，同时避免 bulk RNA-seq 中不同细胞信号被平均，使深入的信息挖掘成为可能，并揭示不同细胞类型中的差异化调控机制。
杨雪瑞课题组的向贤珂博士因此提出创新方法学思路，利用单细胞之间天然存在的剪接异质性，通过可解释机器学习反向解析其背后的调控因子，由此开发了CASREL（cell-specific alternative splicing regulation inference via explainable learning）方法。CASREL以梯度提升决策树（GBDT）为核心机器学习模型，从大量单细胞中学习RBP表达与RNA剪接状态之间的复杂关系，再利用可解释人工智能对模型进行拆解，识别对特定剪接事件预测起重要作用的RBP。由此，机器学习不再只是用于预测的“黑箱”，而可以进一步成为发现潜在分子调控关系的“藏宝图”。这一策略不依赖预先已知的RBP-RNA结合关系，也无需逐一开展大规模RBP扰动实验。
该方法还有一个关键的技术创新：对单细胞RNA剪接数据中大量存在的“缺失值”（drop-out，标记为NA）的重新认识。对组学数据中常见的数据缺失，传统分析通常将NA值删除或推断填补。向贤珂博士对单细胞剪接谱的NA值分布进行了一系列理论分析，利用信息论、机器学习模型，证明NA值在不同细胞中的分布并非随机，其模式本身具有丰富的细胞类型、剪接异构体相关信息。因此，CASREL机器学习方法没有像其它常规策略一样删除NA值或进行量化数据填补，而是将其保留为一种独立状态。一系列的测试表明，这一技术创新显著提高了剪接状态预测和调控因子识别的效果。这提示，单细胞数据中一些看似需要被消除的“缺陷”，也可能蕴含尚未被利用的生物学信息。
研究团队利用多个独立单细胞数据集，并结合RBP敲低实验和RNA-蛋白质结合数据，对CASREL进行了系统验证。结果表明，CASREL能够有效识别具有生物学意义的RBP-RNA剪接关联，且RNA剪接调控网络具有明显的细胞类型特异性，如同一个RNA剪接事件在CD4⁺和CD8⁺ T细胞中可能受到不同RBP组合的调控，而来自不同肿瘤组织的同类T细胞则表现出更为一致的调控特征。
总之，CASREL所体现的核心思路是：单细胞之间的天然差异不仅是需要处理的异质性，也可以成为发现调控机制的信息来源。通过可解释机器学习，可以将这种细胞间差异转化为寻找潜在分子调控关系的线索，并以单细胞为学习对象，解析不同复杂生理组织内不同细胞类型的剪接调控。单细胞转录组测序是研究复杂组织中细胞异质性的核心技术，然而绝大多数的分析均集中于基因总体表达层面，忽略了RNA可变剪接异质性在塑造生理状态、执行生物学功能及驱动疾病发展过程中的关键作用。杨雪瑞课题组此前开发的 SCASL 方法重点解决单细胞RNA剪接状态及其异质性的定量分析问题；此次开发的 CASREL 则进一步从剪接异质性定量分析推进至剪接异质性调控因子的解析，从而形成前后衔接的单细胞RNA剪接分析框架。
清华大学生命科学学院2024届博士毕业生向贤珂为本论文第一作者，杨雪瑞教授为论文通讯作者。国家蛋白质科学研究（北京）设施（清华大学蛋白质研究技术中心）下属生物计算平台、基因测序与分析平台为本研究提供了重要支持。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-026-77627-5
